、菌种的制备

菌种制备的主要目的是尽可能地培养出高活性、能满足大规模发酵需要的纯种，主要方式为：分离纯化和扩大培养，分离纯化是为了保证菌种的性能稳定，般2个月左右就应分离纯化次，分两步进行，

步是用平板稀释法分离出单细胞菌落，具体方法是把待分离的菌株用无菌生理盐水制成菌悬液，并在装有玻璃珠的三角瓶中充分振荡（或者在摇床上振荡20~30min），利用玻璃珠的滚动使菌体细胞分散，然后将菌悬液稀释成定的浓度，分别做平板培养，使被分离的单细胞长成单菌落；

二步是挑取若下单细胞菌落接种于试管斜面培养基上，然后把这些菌株分别用三角瓶进行摇瓶发酵试验，比较各蒸株产酸的高低，选择产酸高的菌株供生产用，扩大培养是菌种制备的主要手段，

其培养顺序为：斜面菌种、种子、二种子。

（1）斜面菌种

斜面菌种是生产用菌种分离纯化后接种于斜面培养基的菌种。

①培养基的制备。

葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0%，pH2.0。分装试管后于0.1MPa火菌30min，摆成斜面，于37℃培养24h，检查无菌后方可使用。

②培养方式。

将原种上的菌苔划线接种到新制斜面上，于37℃培养24h，制成斜面菌种。

③制备要点。

a.培养完成后，要观察菌苦的生长情况，菌苔的边缘和颜色等特征是否正常，有无感染杂菌的迹象。

b.斜面菌种应保存于冰箱中。

c.生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，般只移接3次（代），避免造成菌种自然变异而引起退化。

（2）种子（三角瓶菌种）的制备

种子是斜面菌种接种于三角瓶进行液体振荡培养的菌种。般用1000mL三角瓶装200~250mL液体培养基，其培养目的在于制备大量高活性的菌体。

①培养基制备。

葡萄糖2.5%，尿素0.5%，0.04%，硫酸氢二钾0.1%，玉米浆2.5%~3.3%，、硫酸钱各2×10-6（0.0002%），pH7.0。用250mL三角瓶装100mL培养基，8层纱布封口，于0.1MPa灭菌30min，冷却后接入斜面菌苦2~3次。

②培养方式。

将接种完毕的三角瓶置于恒温摇床上，培养温度为30~32℃，培养12h。

③种子质量标准。

种龄12h，△A（560nm吸光度净增值）>0.5，RG（残糖）0.5%以下，pH6.4+0.1。

（3）二种子（种子罐种子）的制备

二种子制备的目的是培养获得与发酵嫌体积及培养条件相称的高活性菌休。二种了数量般是按发酵罐体积实际定容（比例为发酵罐体积的70%）的1%进行培养。如7L发酵罐实际定容为4.9L，二种子即为49mL。

①培养基制备。

葡萄糖2.5%，尿素0.34%，硫酸氢二钾0.16%，糖蜜1.16%，0.043%，消泡剂1mL/L，、硫酸锰各2×10-（0.0002%），pH7.0。

②培养方式。

根据种子锥-发酵罐操作规范，对种子罐进行空消后加入培养基，再进行实消。实消条件为0.1MPa30min，冷却后火焰接种，接种量为培养基的2%，控制培养条件，温度37℃，搅拌机转速220r/min，每分钟通气量0.8：1（体积比），培养10h。

③二种子菌种的质量要求。

a.菌体大小均匀，呈单个或“八”字形排列，细胞呈蒂状略有弯曲，革兰氏染色为阳性。

b.二种子培养过程中pH的变化有定的规律，先从pH6.8上升到pH8.0左右，然后逐步下降。当二种子pH下降到7.0~7.2时，结束二种子的培养，这个变化过程需7~10h。如果培养时间过长会让pH继续下降，菌体容易衰老。

c.活菌浓度要求达到1000万~1亿个/mL，生产实践中应用光电比色计或分光光度计实际检测二种子培养液的吸光度A的增长值大于或等于0.6。

二、培养基的制备

依据棒状杆菌的生理生化特性，选择适宜的培养基进行菌种的制备是进行发酵的要前提，按工艺要求配制发酵培养基，发酵罐定容后的装填系数为0.7，例如5001发酵罐定容至350L，700L发酵罐定容至490L。实际配制时，定容到预定体积的75%左右（即500L发酵罐定容到约260L，700L发酵罐定容到约370L），另25%体积为蒸汽冷凝水和种子液预留。

1.培养基配方

葡萄糖13%、0.06%、硫酸氢二钾0.1%、糖蜜0.3%，MnSO，和FeSO，各2×10-，氯氧化钾0.04%，玉米浆粉0.125%，消泡剂0.2%，pH7.0，实饿灭菌温度为115℃，20min。

尿素配成质量分数为40%的溶液，装在1000ml。的三角瓶中，每瓶装800ml，于108℃单灭菌15min，备用。

2.培养麸配制操作

打开发酵罐盖上的加料口，将培养基原液加入发酵罐内。补充水分达到预定体积的75%左右，拧紧加料孔螺母（注意：不要拧得太紧，否则会损坏密封圈）。开动搅拌机，防止培养基液结块。