1、操作时间尽量短，操作步骤尽量少。无论是从培养箱拿出来，到trypsin消化，到离心等，这些对细胞来说，都属于是stress。因此，我们要缩短整体的操作时间，减少操作步骤。

a）对于好消化的细胞来说，不需要将细胞消化到漂起来、加培养基终止后离心，可以在消化到差不多快要脱落的时候，移除大部分trypsin，稍候片刻，直接加培养基将细胞吹打下来，省去离心步骤。残余的trypsin由于含量很低，所以不会对细胞产生任何影响。

b）对于难消化的细胞，我倒是建议用无钙镁PBS洗涤一次后，加入稍微多一点trypsin置37度消化至脱落（一晃细胞就掉下来的那种），然后再加培养基终止、离心。这么做的道理是，细胞消化不，势必会增加吹打辅助脱落的次数。而吹打次数越多，细胞活性越差。

值得注意的是，有些特殊的细胞，不可以使用trypsin作为消化液。比如我有一株纯由EGFRvIII基因驱动、不含其他生长因子信号通路基因突变的肿瘤细胞，用trypsin消化之后，形态会发生剧变，要等两天才能恢复。经进一步实验发现，原来是trypsin剪切了EGFRvIII（室温2分钟就干掉20%的EGFRvIII）。而使用trypLE就不会有这种现象，相应地，流式数据提示仅丢失5%不到的信号。所以遇到比较脆的细胞，比如干细胞和一些肿瘤PDC，要测试一下何种消化液可用。

2、明白每一种细胞对营养物质的需求。我看过无数protocol使用PBS做细胞重悬、染色等活细胞实验的缓冲液。短时间的话，这并没有什么问题。但是，经典的PBS配方中并不含葡萄糖、氨基酸等营养物质。因此，细胞在PBS中待的时间长的话，活性会受到极大的影响。我曾经做过一个实验，分别用PBS和HBSS（后者含葡萄糖）重悬同一份细胞样品，上流式进行单细胞分选到96孔板。*后，HBSS组超过50%的孔长出克隆，而PBS组则低于5%。对于一些非常敏感的细胞来说，比如神经元，连洗涤都要使用含糖及其他营养物质的buffer。