通过单因素试验，确定树舌灵芝的适宜氮源为豆饼粉，适宜碳源为米糠和蔗糖；在此基础上，以筛选的碳源、氮源和无机盐KH2PO4 和MgSO4·7H2O为考察因素，以总三萜产量为主要指标利用正交试验优化培养基配方比例，确定树舌灵芝液体发酵培养基配方为：米糠4%、蔗糖1%、豆饼粉4%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%。 

  一、 （材料和仪器 ）

1、实验所需材料  、硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、、、高氯酸、冰醋酸、均为分析纯；对照品，中国药品生物制品检定所；豆饼粉、玉米粉、麦芽粉、甘薯粉、米糠和麸皮均为提取液，煮沸0.5h后用纱布过滤制得。 

2、实验用主要仪器设备

鼓风干燥箱，立式高压灭菌锅，电子天平，紫外分光光度计，恒温水浴锅，恒温摇床，恒温培养箱。 

二、（实验方法  ：基本培养基） 

1.1 斜面培养基  PDA培养基为土豆20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然。接一块绿豆粒菌块接种于PDA培养基的，放入恒温培养箱中25℃恒温培养7天。 

1.2 液体培养基  玉米粉1%，蔗糖2%，蛋白胨0.5%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。 

1.3 氮源筛选培养基  葡萄糖2%，可溶性淀粉1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，PH自然。分别以豆饼粉、麸皮、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、、氯化铵、硝酸钾为氮源，添加量为2%。 

1.4 碳源筛选培养基  麸皮2%，KH2PO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉、麦芽粉、甘薯粉、米糠等为碳源，添加量为3%。 

培养方法 

2.1 种子液制备  将斜面菌种分割成黄豆大小，接种到液体培养基中，250mL三角瓶装液量100mL，于恒温摇床中25℃，120r/min振荡培养10d得一级种。将已经培养好的一级种以体积分数10%接种到同样液体培养基中，500mL三角瓶装液量200mL，在与一级种同样条件下培养7d得种子液备用。 

2.2 培养基筛选  将制备好的种子液按体积分数10%接种量接种到不同的碳氮源培养基及正交试验筛选培养基中，250mL三角瓶装液量100mL，于恒温摇床中25℃，120r/min振荡培养7d后收集菌丝体。分析不同碳源、氮源对菌丝体生物量和三萜总量的影响。每次试验重复3次，结果取平均值。 

2.3 混合碳氮源培养基正交试验  根据单因素试验筛选结果，并考虑到低投入高产出的原则，选用米糠和蔗糖作为复合碳源，豆饼粉作为氮源，磷酸二氢钾和作为无机盐，按L9（34）设计四因素三水平试验，9个组合，4次重复，优化培养基。 

2.4 发酵菌丝体生物量测定  采用细胞干重法，取100ml发酵液，用100目纱网过滤得菌丝体，并用蒸馏水反复冲洗，至滤出液澄清为止，收集菌丝体，于60℃鼓风干燥箱中烘干至恒重，称重。 

三、（三萜含量测定） 

3.1 标准溶液的制备（200μg/ml） 称取干燥至恒重的20mg，置于100ml的容量瓶中加无水乙醇溶解，并定容至刻度，作为对照品溶液。 

3.2 样品溶液的制备   取样品0.5g（精准到万分），加入10ml无水乙醇，超声波提取30min后，摇匀，过滤，取滤液，定容至50mL，即得样品溶液。用分光光度法测定样品中灵芝三萜物质含量。 

3.3 标准曲线的制作   精密吸取标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL, 于6只具塞磨口试管中。加5%-冰醋酸液0.4mL，摇匀。再加入0.6mL高氯酸，置于60℃恒温水浴锅中20 min，冰浴冷却后，加冰醋酸5.0 mL，摇匀，置于室温15 min后，按分光光度法（《中国药典》2005版 I部附录VA），以试剂为空白，在545nm处比色测定吸光度值。以浓度（g/ml） 为横坐标，吸光度A为纵坐标，作图得标准曲线。 

3.4 样品的测定   吸取1ml样品溶液，按标准曲线方法测定吸光度。用标准曲线法计算样品中总三萜酸提取物质量。 

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