一、 目的

使用恒温培养箱、恒温水浴锅了解细胞分裂素对离体子叶的保绿作用及基本原理和方法。

二、原理 细胞分裂素可阻碍核酸水解酶和蛋白水解酶的产生，因此能延缓器官衰老，使离体叶片保绿，保绿作用的强弱可通过测定叶绿素含量的变化来衡量，也可由叶色变黄枯死的时间来衡量。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：黄瓜子叶；萝卜子叶。

2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温培养箱；恒温水浴锅；25ml容量瓶；25ml刻度试管；试管架；移液管；黄瓜子叶的培养皿（直径5cm）；瓷盘；刀片；尖头镊子；滤纸；吸耳球等。

3. 试剂及配制：100μg·ml－16－BA溶液；95﹪乙醇 ；CaCO3粉末。 100μg·ml－16－BA母液配制：准确称取6－BA 10mg, 加几滴1mol·L－1HC1溶解（可稍加热溶解），然后慢慢加入蒸馏水稀释后定容至100ml。

四、实验步骤

1. 黄瓜幼苗的培养 精选黄瓜种子，播入垫有滤纸的瓷盘中，加蒸馏水使之湿润（注意种子不能渍水），待种子萌发后，在光下培养2～3d左右，直至子叶绿化。备用。

2. 系列浓度6－BA溶液配制：吸取100μg·ml－16－BA母液，稀释成10、5、0.5 μg·ml－1的系列浓度溶液。

3. 离体黄瓜子叶的培养

（1）取4套培养皿，编号，每套培养皿各垫一张滤纸，分别作0.5、5、10μg·ml－1的6－BA溶液和蒸馏水(CK)4个处理，即为组。

（2）选取子叶大小、生长一致的黄瓜幼苗20株，每处理5 株（10片子叶），用刀片切下不附带叶柄的子叶，分别称取鲜重，将数据记入下表中。然后将子叶放入组相应编号的培养皿中，分别加入不同浓度的6－BA溶液3ml, 对照（CK）加蒸馏水3ml。盖上培养皿盖，置于暗处，温度25－28℃培养3 d 。 另取与组相同的黄瓜幼苗20株，用刀片切下不附带叶柄的子叶作第二组，直接用来测定叶绿素含量。

4. 第二组黄瓜子叶叶绿素含量的测定

（1）叶绿素的提取 取3支25ml刻度试管，编号。称取第二组的黄瓜子叶三份（3个重复），每份10片子叶，然后放入相应编号的刻度试管中，各加入少量CaCO3粉及95﹪乙醇3－4ml，用玻棒小心将子叶捣碎后，将试管放入45℃恒温水浴提取叶绿素30min左右，直到子叶碎片无色为止，用滤纸过滤于25ml容量瓶中（如残渣仍带绿色，可再加几ml乙醇继续提取，直至残渣无绿色）。滤纸上的色素用乙醇慢慢点滴清洗入容量瓶中，*后定容至刻度，摇匀，待测。

（2）叶绿素含量的测定 在652nm波长处，以95﹪乙 醇为空白对照，测定叶绿素提取液的吸光度（A值）。并按公式计算出叶绿素含量。即为培养前子叶的原始叶绿素含量。

5. 组黄瓜子叶叶绿素残留量的测定 组黄瓜子叶在暗处培养3d后，按上述第（4）步骤方法分别测定各处理子叶叶绿素含量，并按公式计算出各处理叶绿素含量，即为暗培养后子叶叶绿素含量。

五、结果计算 叶绿素含量计算公式：

D652 × 提取液总量（ml） 叶绿素含量（mg·g－1Fw）= —————————————— 34.5 × 样品鲜重（g） 公式中：D652 — 在652nm波长下测定的吸光度值 34.5— 叶绿素a、b在652nm波长处的比吸收系数 培养后叶绿素含量 暗培养后叶绿素含量占培养前叶绿素含量（﹪）= —————————×100 培养前叶绿素含量

六、恒温培养箱、恒温水浴锅详情可咨询喆图小编。

原创作者：上海喆图科学仪器有限公司